本生詳述：熒光定量 PCR 原理_技術(shù)文章_本生（天津）健康科技有限公司

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本生詳述：熒光定量 PCR 原理
閱讀次數(shù)：15359 發(fā)布時間：2022/9/13 9:41:39

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標簽：熒光定量 PCR PCR 試劑實時熒光定量 PCR 耗材

所謂實時熒光定量 PCR 技術(shù) ，是指在 PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個 PCR 進程，通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。以下便是天津本生生物就熒光定量 PCR 原理的簡要說明，一起來看下：

檢測方法：

1.SYBRGreenⅠ法：在 PCR 反應(yīng)體系中，加入過量 SYBR 熒光染料，SYBR 熒光染料特異性地摻入 DNA 雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而熒光信號的增加與 PCR 產(chǎn)物的增加同步。SYBR 定量 PCR 擴增熒光曲線圖 PCR 產(chǎn)物熔解曲線圖 (單一峰圖表明 PCR 擴增產(chǎn)物的單一性)

2.TaqMan 探針法：探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR 擴增時，Taq 酶的 5』-3』外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物的形成同步。

1. 熒光閾值 (threshold) 的設(shè)定 PCR 反應(yīng)的 15 個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺省 (默認) 設(shè)置是 3-15 個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的 10 倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-152. Ct 值與起始模板的關(guān)系每個模板的 Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，公式如下。Ct =-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n 為擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，X0 為初始模板量，Ex 為擴增效率，N 為熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量。起始拷貝數(shù)越多，Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代 Ct 值。因此，只要獲得未知樣品的 Ct 值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

實時熒光定量 PCR 所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：

1. TaqMan 熒光探針：PCR 擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR 擴增時，Taq 酶的 5＇-3＇外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物形成同步。而新型 TaqMan-MGB 探針使該技術(shù)既可進行基因定量分析，又可分析基因突變 (SNP)，有望成為基因診斷和個體化用藥分析的當選技術(shù)平臺。

2. SYBR 熒光染料：在 PCR 反應(yīng)體系中，加入過量 SYBR 熒光染料，SYBR 熒光染料非特異性地摻入 DNA 雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而熒光信號的增加與 PCR 產(chǎn)物的增加同步。SYBR 僅與雙鏈 DNA 進行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定 PCR 反應(yīng)是否特異。

3. 分子信標：是一種在 5 和 3 末端自身形成一個 8 個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR 產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標中間部分與特定 DNA 序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。

1. 傳統(tǒng)定量 PCR 方法簡介：

1) 內(nèi)參照法：在不同的 PCR 反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標和引物，內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內(nèi)標也被擴增。在 PCR 產(chǎn)物中，由于內(nèi)標與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。

2) 競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增 (其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內(nèi)切酶消化 PCR 產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。3)PCR-ELISA 法：利用 digaoxin 或生物素等標記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合，再加入抗 digaoxin 或生物素酶標抗體-辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的 PCR-ELISA 法只是定性實驗，若加入內(nèi)標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

2. 內(nèi)標在傳統(tǒng)定量中的作用由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測，即 PCR 到達平臺期后進行檢測，而 PCR 經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時，檢測重現(xiàn)性差。同一個模板在 96 孔 PCR 儀上做 96 次重復實驗，所得結(jié)果有很大差異，因此無法直接從終點產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

3. 內(nèi)標對定量 PCR 的影響若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標，則 PCR 反應(yīng)變?yōu)殡p重 PCR，雙重 PCR 反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標。也正是這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標，但仍然只是一種半定量的方法。實時熒光定量 PCR 技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品 Ct 值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。

因此，實時熒光定量 PCR 無需內(nèi)標是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1)Ct 值的重現(xiàn)性 PCR 循環(huán)在到達 Ct 值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期 (對數(shù)期)，此時微小誤差尚未放大，因此 Ct 值的重現(xiàn)性好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的 Ct 值是恒定的。

2)Ct 值與起始模板的線性關(guān)系由于 Ct 值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量 PCR 是一種采用外標準曲線定量的方法。外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量 PCR 是迄為止定量準確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到全的公認，廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多域。各各類醫(yī)療機構(gòu)、大學及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。由于 qPCR 是實時定量檢測致病病原體基因核酸，因此它比化學發(fā)光、時間分辨、蛋白芯片等免疫學方法更具獨到優(yōu)

產(chǎn)品優(yōu)勢：
本生生物代理實驗室耗材,PCR 耗材品種全，可替代儀器原廠耗材，性價比高，質(zhì)量穩(wěn)定，對用戶可以節(jié)省實驗成本。

適應(yīng)客戶：
醫(yī)院檢驗科 PCR 實驗室，中心實驗室，肝病中心；第三方檢測機構(gòu)，科研院所，大院校，制藥廠，試劑生產(chǎn)廠家，疾控中心，檢驗檢疫。

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