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　　BUNSEN本生——透析袋的原理、根據(jù)分子量篩選，使用方法的解析

　　一、透析的原理

　　透析只需要使用用的半透膜即可完成。通常是將半透膜制成袋狀，將生物大分子樣品溶液置入袋內(nèi)，將此透析袋浸入水或緩沖液中，樣品溶液中大分子量的生物分子被截留在袋內(nèi)，而鹽和小分子物質(zhì)不斷擴散透析到袋外，直到袋內(nèi)外兩邊的濃度達到平衡為止。保留在透析袋內(nèi)未透析出的樣品溶液稱為“保留液”，袋(膜)外的溶液稱為“滲出液”或“透析液”。

　　透析的動力是擴散壓，擴散壓是由橫跨膜兩邊的濃度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶質(zhì)在膜內(nèi)外兩邊的濃度梯度，還正比于膜的面積和溫度，通常是4℃透析，升高溫度可加快透析速度。

　　二、透析的過程

　　1)把適量的透析液(緩沖液)加入透析裝置。透析液的體積應(yīng)為樣品體積量的100倍。(例如，在1L透析液中透析10ml的樣品)

　　2)裁剪適當(dāng)長度的透析管。預(yù)留一段額外長度(約占總樣品體積量的20%)作為頭部空間。

　　3)把透析管插入打開的透析夾，在約超出透析夾3-5mm的位置再夾住。不要折疊透析袋。

　　4)由透析管開口端將樣品裝入。調(diào)整一下頂部空間的長度，夾緊透析夾。

　　5)把透析樣品放在合適的透析緩沖液中。

　　6)透析要根據(jù)具體的應(yīng)用需求。通常情況下，允許過夜透析。在持續(xù)透析的過程中，至少要進行3次全部更換透析液。建議在(透析后)2-4小時，6-8小時和10-14小時(第二天早晨)更換透析液。在一次透析液的更換后，要至少繼續(xù)進行2小時的透析。

　　注意：對于高濃度污染物，樣品可能需要較長的時間透析，透析液需要更頻繁的更換。

　　7)透析溫度主要取決于樣品。溫度限制主要取決于膜的類型。纖維素透析袋可以承受的溫度高達37℃。再生纖維素透析袋可以承受的溫度高達60℃。

　　三、透析袋的材質(zhì)與規(guī)格

　　透析膜可用動物膜和玻璃紙等，但用的多的還是用纖維素(再生纖維素 RC、纖維素酯CE、PVDF等)制成的透析膜，目常用的是美國光譜醫(yī)學(xué)公司(spectrum)和美國聯(lián)合碳化物公司(union carbide)生產(chǎn)的各種尺寸的透析管。截留分子量MwCO(即留在透析袋內(nèi)的生物大分子的小分子量，縮寫為MwCO)大概有100、500、1000、2000、3500、8000、10000、15000、20000、25000、50000、100000、250000、500000、1000000等種類，單位為道爾頓(D)。截留分子量越大也就是說透過性越大，一般而言，透析袋截留分子量越小價格越貴，因為截留的分子越小要求透析袋越密，價格越貴。商品透析袋制成管狀，其扁平寬度為8mm-77mm不等。

　　半透膜制成的透析袋作為工具，存在透析時間長、樣品回收率不高、無法處理微量樣品的難題。目已有為10到100ul的微量樣品透析而設(shè)計的透析工具。把樣品加在平底的透析管(類似小量提質(zhì)粒的離心純化柱，可以插入1.5ml的離心管中，管底是半透膜)中，再插入特制的浮板(浮漂)中，置于緩沖液面10min即完成透析。實驗表明，100ul pH2.8的IgG洗脫液在1L pH9.4的緩沖液中只需不到10min即可平衡到pH9.4。如果在裝緩沖液的燒杯底加磁力棒攪拌則更能加速透析速度。這種方法有較高的回收率，能夠節(jié)約珍貴的樣品，并能節(jié)約時間，特別適合摸條件的預(yù)實驗。

　　透析袋的標(biāo)識：

　　1)27mm(MD34)透析袋(MW：3500)

　　27mm是指透析袋干燥時的直徑。

　　MD34mm是指透析袋干燥時壓平的寬度。

　　MW：3500是指透析袋的截留分子量。

　　2)選擇適合的透析膜材質(zhì)

　　每種膜對不同的分子具有不同的親和性。對于球蛋白，相對的結(jié)合親和性由低到高為CE

　　透析袋使用的處理

　　方法一：

　　把透析袋剪成適當(dāng)長度(10-20cm)的小段。

　　在大體積(500ml)的2%(w/v)的碳酸氫鈉和1mmol/L EDTA2Na(pH=8.0)中將透析袋煮沸10min。

　　用蒸餾水清洗透析袋。

　　放在500ml的1mmol/L EDTA2Na(pH=8.0)中將之煮沸10min。

　　冷卻后，置于30%或者50%的酒精中，放于4℃冰箱，必須確保透析袋始終浸沒在溶液內(nèi)。從此時其取用透析袋必須戴手套。

　　在使用要用蒸餾水將透析袋里外加以清洗干凈。

　　方法二：

　　可先用50%乙醇煮沸1h，再依次用50%乙醇、0.01mol/L碳酸氫鈉和1mmol/L EDTA(pH=8.0)溶液洗滌，用蒸餾水沖洗即可使用。

　　方法三：

　　實驗要求不高的可以用簡易方法處理。用沸水煮5至10min，再用蒸餾水洗凈，即可使用。

　　不過現(xiàn)在也有雜質(zhì)含量少，無需預(yù)處理，只需用去離子水清洗即可使用的即用型透析袋。這種透析袋具有特殊的生物技術(shù)膜，不含硫化物及金屬雜質(zhì)。只是比普通型透析袋稍貴。

　　3)透析袋濃縮樣品

　　大多數(shù)情況下，透析袋純化的樣品會被稀釋。如果下游需要的樣品濃度比較高時，可能需要對樣品進行濃縮。透析袋本身濃縮的方法如下。

　　(1)吹干濃縮法： 將蛋白溶液裝入透析袋內(nèi)，放在電風(fēng)扇下吹。此法簡單，但速度慢，且溫度不能過高，不要超過15℃。

　　(2)透析袋濃縮法： 利用透析袋濃縮蛋白質(zhì)溶液是應(yīng)用廣的一種。將要濃縮的蛋白溶液放入透析袋(無透析袋可用玻璃紙代替)，結(jié)扎，把高分子(6000-12000)聚合物如聚乙二醇(碳蠟)、聚乙/烯吡/咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可將吸水劑配成30%-40%濃度的溶液，將裝有蛋白液的透析袋放入即可。吸水劑用過后，可放入溫箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。

　　主要用于更換蛋白質(zhì)的緩沖液，得有透析袋。不需要特殊的儀器。一般用得是PEG20000進行實驗，簡單，快速，對蛋白沒什么影響。

　　此外，還有其他的樣品濃縮方法，如冷凍干燥濃縮法、超濾膜濃縮法等。

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原創(chuàng)作者：本生（天津）健康科技有限公司