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　　ELIS實(shí)驗(yàn)問(wèn)題講解：試劑盒分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)
 

　　血清是常用的標(biāo)本，血漿一般可視為與血清同等的標(biāo)本，標(biāo)本引起的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果主要是干擾性物質(zhì)所致，ELISA 試劑盒分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)兩種：

　　1. 內(nèi)源性物質(zhì)

　　普遍認(rèn)為大約 40% 的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測(cè)結(jié)果。常見的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠 Ig(s)抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等。

　　(1)類風(fēng)濕因子

　　人血清中 IgM、IgG 型類風(fēng)濕因子(RF)可以與 ELISA 系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標(biāo)記二抗的 FC 段直接結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性。解決該情況的辦法是：①用 F(ab)2 替代完整的 IgG;②標(biāo)本用聯(lián)有熱變性(63℃，10 min)IgG 的固相吸附劑處理(將熱變性 IgG 加入到標(biāo)本稀釋液中同樣有效);③檢測(cè)抗原時(shí)，可以用 2-Hydroxy-1-ethanethiol 等加入到標(biāo)本稀釋液中，使 RF 降解。

　　(2)補(bǔ)體

　　ELISA 系統(tǒng)中固相一抗和標(biāo)記二抗過(guò)程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu)，其 FC 段的補(bǔ)體 C1q 分子結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來(lái)，使 C1q 可以將二者連接起來(lái)，從而造成假陽(yáng)性。解決的辦法是：①用 EDTA 稀釋標(biāo)本;②用 53℃，10 min 或 56℃，30 min 加熱血清使 C1q 滅活。

　　(3)嗜異性抗體

　　人類血清中含有能與嚙齒類動(dòng)物(如鼠等)Ig(s)結(jié)合的天然嗜異性抗體，可將 ELISA 系統(tǒng)中一抗和二抗連接起來(lái)，也能造成假陽(yáng)性。解決的辦法是：可在標(biāo)本稀釋液中加入過(guò)量的動(dòng)物 Ig(s)，但加入量不足或亞類不同時(shí)無(wú)效。

　　(4)嗜靶抗原的自身抗體

　　抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體，ELISA 試劑盒有時(shí)能與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，在 ELISA 方法中均可干擾抗原抗體測(cè)定結(jié)果。為避免以上情況出現(xiàn)，解決的辦法是：測(cè)定需用理化方法將其解離后再測(cè)定。

　　(5)醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠 Ig(s)抗體

　　人 ELISA 試劑盒臨床開展的用鼠源性 CD3 等單克隆抗體治療，用放射性同位素標(biāo)記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術(shù)，均有可能使這些病人體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體;另外，被鼠等嚙齒類動(dòng)物咬傷的病人體內(nèi)也可以產(chǎn)生抗鼠 Ig(s)抗體。這些病人 ELISA 測(cè)定時(shí)均可產(chǎn)生假陽(yáng)性。解決的辦法是：測(cè)定抗原時(shí)，在標(biāo)本中加入足量的正常鼠 Ig(s)，從而克服由于上述原因造成的假陽(yáng)性。

　　(6)交叉反應(yīng)物質(zhì)

　　類 AFP 樣物質(zhì)等，是與靶抗原有交叉反應(yīng)的物質(zhì)。在用多抗測(cè)定抗原時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大，但在用單克隆抗體測(cè)定抗原時(shí)，如果交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對(duì)應(yīng)的靶決定簇時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

　　(7)標(biāo)本中其它成分的影響 血清脂質(zhì)過(guò)高、膽紅素、血紅蛋白及血液粘度過(guò)大等，均對(duì) ELISA 測(cè)定結(jié)果有干擾作用。

　　2. 外源性物質(zhì)

　　外源性物質(zhì)常常是由于用于 ELISA 測(cè)定的血標(biāo)本的采集、貯存不當(dāng)?shù)仍�因所致。如�?biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存過(guò)久、標(biāo)本凝集不全和采血管中添加物等影響。

　　(1)標(biāo)本溶血

　　由于各種人為原因引起的標(biāo)本溶血，均可因紅細(xì)胞破壞溶解時(shí)釋放出大量具有過(guò)氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過(guò)氧化物酶為標(biāo)記的 ELISA 測(cè)定中，會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色，干擾測(cè)定結(jié)果。為克服上述干擾作用，標(biāo)本采集時(shí)必須注意避免溶血。

　　(2)標(biāo)本受細(xì)菌污染

　　因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過(guò)氧化物酶，因此，被細(xì)菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而測(cè)定結(jié)果。

　　(3)標(biāo)本保存不當(dāng)

　　在冰箱中保存過(guò)久的標(biāo)本，血清中 IgG 可聚合成多聚體、AFP 可形成二聚體，在間接法 ELISA 測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深、甚至造成假陽(yáng)性;標(biāo)本放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(如一天以上)，有時(shí)抗原或抗體免疫活性減弱，亦可出現(xiàn)假陰性。為克服上述干擾，ELISA 測(cè)定的血清標(biāo)本宜為新鮮采集;如不能立即測(cè)定，5 天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可存放于 4℃，1 周后測(cè)定的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存;凍存后融解的標(biāo)本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混合后再測(cè)定，但混勻時(shí)應(yīng)輕柔，不可強(qiáng)烈振蕩。

　　(4)標(biāo)本凝集不全

　　在沒有促凝劑和抗凝劑存在的情況下，正常血液采集后 1/2～2 h 開始凝固，18～24 h 凝固。臨床檢驗(yàn)工作中，有時(shí)為了爭(zhēng)取時(shí)間快速檢測(cè)，常在血液還未開始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清，此時(shí)的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在 ELISA 測(cè)定過(guò)程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽(yáng)性結(jié)果;這類情況于次日復(fù)查時(shí)因血凝已，血清中不再有纖維蛋白原存在，故復(fù)查結(jié)果變?yōu)殛幮�。為避免上述干擾作用，解決的辦法 zui 好是血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽��?/p>

　　(5)人 ELISA 試劑盒標(biāo)本管中添加物質(zhì)的影響

　　抗凝劑(如肝素，EDTA)、酶抑制劑(如 NaN3 可抑制 ELISA 系統(tǒng)中辣根過(guò)氧化物酶活性)及快速分離血清的分離膠等均對(duì) ELISA 測(cè)定有一定干擾作用。

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