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　　人腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫分析技術說明書
 

　　本試劑僅供研究使用

　　目的：本試劑盒用于測定人血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量。

　　實驗原理：本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。用純化的人腫瘤壞死因子α(TNF-α)捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入人腫瘤壞死因子α(TNF-α)，再與HRP標記的檢測抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人腫瘤壞死因子α(TNF-α)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中人腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量。

　　試劑盒組成：試劑盒組成48孔配置96孔配置保存說明書1份1份封板膜2片2片密封袋1個1個酶標包被板1×481×962-8℃保存標準品0.3ml×6管0.3ml×6管2-8℃保存酶標試劑5ml×1瓶10ml×1瓶2-8℃保存樣品稀釋液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存顯色劑A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存顯色劑B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存終止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存20×濃縮洗滌液15ml×1瓶25ml×1瓶2-8℃保存注：標準品濃度依次為：48、24、12、6、3、0pg/mL.

　　樣本處理及要求：

　　1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。

　　2.血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。3.尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。4.細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液，細胞2濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。5.組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆�。標本融化后仍然保�?-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4)，用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。6.標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.7.不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。操作步驟1.標準品的加樣：設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;。

　　2.加樣：分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl(樣品終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

　　3.加酶：每孔加入酶標試劑100μl，空白孔除外。

　　4.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。5.配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。

　　6.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30后棄去，如此重復5次，拍干。

　　7.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

　　8.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(此時藍色立轉黃色)。

　　9.測定：以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

　　人腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫分析ELISA試劑盒使用說明書

　　注意事項：

　　1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。樣本在使用也要在室溫平衡60分鐘。

　　2.濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

　　3.各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

　　4.請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高(樣本OD值大于標準品孔孔的OD值)，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測定，計算時請乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。5.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

　　6.底物請避光保存。

　　7.嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

　　8.所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

　　9.本試劑不同批號組分不得混用。

　　10.如與英文說明書有異，以英文說明書為準。3計算：以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。(此圖僅供參考)

　　試劑盒性能：1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.95以上。2.批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應分別小于10%和15%。

　　檢測范圍：1.5pg/mL-48pg/mL靈敏度：檢測濃度小于0.1pg/mL

　　保存條件及有效期：

　　1.試劑盒保存：2-8℃。

　　2.有效期：6個月

　　人腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒本生一直視質量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承：遵紀守法，嚴于律己，寬仁以待，敢于承擔的企業(yè)精神作為標準，以過硬的質量和優(yōu)良的服務來維護和拓展市場，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作，共創(chuàng)美好的未來。

原創(chuàng)作者：本生（天津）健康科技有限公司