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　　技術(shù)分享：ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因分析
 

　　ELISA即酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，是一種常用的固相酶免疫測(cè)定方法。Engvall 和Perlmann于1971年先應(yīng)用該法進(jìn)行了IgG定量測(cè)定，并命名為"enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)"。 ELISA的基本原理是：

　�、偈�抗原(或抗體)結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性;

　　②使抗原(或抗體)與某種酶聯(lián)結(jié)成酶標(biāo) 抗原(或抗體)，而且此酶標(biāo)抗原(或抗體)既保留其免疫活性，又保留其酶活性;

　�、蹨y(cè)定時(shí)將受檢標(biāo)本(抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原(或 抗體)按不同步驟與固相載體表面的抗原或抗體進(jìn)行反應(yīng)，再用洗滌方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分開，后結(jié)合 在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢的抗體或抗原量成一定比例;再加入酶反應(yīng)底物后，底物被酶催化后變?yōu)橛猩�產(chǎn)物，根據(jù)其顏色反應(yīng)的 深淺進(jìn)行定性或定量分析，以了解被測(cè)標(biāo)本中抗體或抗原含量。

　　ELISA方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定。但ELISA測(cè)定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術(shù)要求，在臨床檢驗(yàn)中 除正常反應(yīng)外，有時(shí)常可見到一些錯(cuò)誤結(jié)果(即假陽性或假陰性結(jié)果)。引起ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有：①標(biāo)本因素;②試 劑因素;③操作因素。本文就標(biāo)本因素對(duì)ELISA測(cè)定的影響做如下討論。 血清是常用的ELISA標(biāo)本，血漿一般可視為與血清同等的標(biāo)本，標(biāo)本引起的假陽性和假陰性結(jié)果主要是干擾性物質(zhì)所致，分為內(nèi)源 性物質(zhì)和外源性物質(zhì)兩種

　　1. 內(nèi)源性物質(zhì) 有人認(rèn)為大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測(cè)結(jié)果。常見的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、嗜異 性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig ( s )抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等。

　　(1)類風(fēng)濕因子 人血清中IgM、IgG型類風(fēng)濕因子(RF)可以與ELISA系統(tǒng)中的捕捉抗體及酶標(biāo)記二抗的FC段直接結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽性。 解決該情況的辦法是：①用F(ab)2替代完整的IgG;②標(biāo)本用聯(lián)有熱變性(63℃，10 min)IgG的固相吸附劑處理(將熱變性IgG加入到標(biāo)本稀釋液中同樣有效);③檢測(cè)抗原時(shí)，可以用2-巰基yi醇等加入到標(biāo)本 稀釋液中，使RF降解。

　　(2)補(bǔ)體 ELISA系統(tǒng)中固相一抗和標(biāo)記二抗過程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu)，其FC段的補(bǔ)體C1q分子結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來，使C1q 可以將二者連接起來，從而造成假陽性。解決的辦法是：①用EDTA稀釋標(biāo)本;②用53℃，10 min或56℃，30 min加熱血清使C1q滅活。

　　(3)嗜異性抗體 人類血清中含有能與嚙齒類動(dòng)物(如鼠等)Ig ( s ) 結(jié)合的天然嗜異性抗體，可將ELISA系統(tǒng)中一抗和二抗連接起來，也能造成假陽性。解決的辦法是：可在標(biāo)本稀釋液中加入過量的動(dòng) 物Ig ( s ) ，但加入量不足或亞類不同時(shí)無效。

　　(4)嗜靶抗原的自身抗體 抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體，有時(shí)能與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，在ELISA方法中均可干擾抗原抗體測(cè)定結(jié)果。 為避免以上情況出現(xiàn)，解決的辦法是：測(cè)定需用理化方法將其解離后再測(cè)定。

　　(5)醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig ( s )抗體 臨床開展的用鼠源性CD3等單克隆抗體治療，用放射性同位素標(biāo)記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術(shù)，均有可能使這些病人體 內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體;另外，被鼠等嚙齒類動(dòng)物咬傷的病人體內(nèi)也可以產(chǎn)生抗鼠Ig ( s )抗體。這些病人ELISA測(cè)定時(shí)均可產(chǎn)生假陽性。解決的辦法是：測(cè)定抗原時(shí)，在標(biāo)本中加入足量的正常鼠Ig ( s ) ，從而克服由于上述原因造成的假陽性。

　　(6)交叉反應(yīng)物質(zhì) 類di高辛、類AFP樣物質(zhì)等，是與靶抗原有交叉反應(yīng)的物質(zhì)。在用多抗測(cè)定抗原時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大，但在用單克隆抗體測(cè)定抗原時(shí) ，假如交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對(duì)應(yīng)的靶決定簇時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

　　(7)標(biāo)本中其它成分的影響 血清脂質(zhì)過高、膽紅su、血紅蛋白及血液粘度過大等，均對(duì)ELISA測(cè)定結(jié)果有干擾作用。

　　2. 外源性物質(zhì) 外源性物質(zhì)經(jīng)常是由于用于ELISA測(cè)定的血標(biāo)本的采集、貯存等不當(dāng)所致。如標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存過久、標(biāo)本凝集 不全和采血管中添加物等影響。

　　(1)標(biāo)本溶血 由于各種人為原因引起的標(biāo)本溶血，均可因紅細(xì)胞破壞溶解時(shí)釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過氧化物酶為標(biāo)記的 ELISA測(cè)定中，會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色，干擾測(cè)定結(jié)果。為克服上述干擾作用，標(biāo)本采集時(shí)必須注重避免溶血。

　　(2)標(biāo)本受細(xì)菌污染 因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，因此，被細(xì)菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測(cè)定結(jié)果。

　　(3)標(biāo)本保存不當(dāng) 在冰箱中保存過久的標(biāo)本，血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體，在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過深、甚至造成 假陽性;標(biāo)本放置時(shí)間過長(如一天以上)，有時(shí)抗原或抗體免疫活性減弱，亦可出現(xiàn)假陰性。為克服上述干擾，ELISA測(cè)定的血清 標(biāo)本宜為新鮮采集;如不能立即測(cè)定，5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可存放于4℃，1周后測(cè)定的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存;凍存后融解的標(biāo)本，蛋 白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混合后再測(cè)定，但混勻時(shí)應(yīng)輕柔，不可強(qiáng)烈振蕩。

　　(4)標(biāo)本凝集不全 在沒有促凝劑和抗凝劑存在的情況下，正常血液采集后1/2~2h開始凝固，18~24h完quan凝固。臨床檢驗(yàn)工作中，有時(shí)為了爭(zhēng)取 時(shí)間快速檢測(cè)，常在血液還未開始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清，此時(shí)的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過程中可以形成 肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果;這類情況于次日復(fù)查時(shí)因血凝已完quan，血清中不再有纖維蛋白原存在，故復(fù)查結(jié)果變?yōu)殛幮? 。為避免上述干擾作用，解決的辦法好是血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血 管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽��?/p>

　　(5)標(biāo)本管中添加物質(zhì)的影響 抗凝劑(如肝素，EDTA)、酶抑制劑(如NaN3可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性)及快速分離血清的分離膠等均對(duì)E LISA測(cè)定有一定干擾作用。 綜上所述，對(duì)臨床檢驗(yàn)ELISA測(cè)定中出現(xiàn)的假陽性或假陰性結(jié)果，在考慮試劑因素和操作因素之外，更多的應(yīng)從標(biāo)本因素方面進(jìn)行分 析，并應(yīng)采取相應(yīng)措施排除干擾作用，從而為臨床提供正確可靠的檢測(cè)結(jié)果。

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